Rv вакцини iii покоління. Кишкові захворювання.

Нами також була зроблена спроба виділити «порожні» віріони з копробіомасси RV. Методом швидкісного центрифугування в переривчастому градиенте щільності хлористого або сірчанокислого цезію (1,0-1,5 г / см2) нам вдалося розділити RV частки на «повні» і «порожні», що підтвердив електронномікроськопічеський контроль.

Таким чином, була встановлена гарантована можливість поділу біомаси RV по їх плавучої щільності, що може бути використано як спосіб або етап очищення, концентрації та накопичення вірусного матеріалу при конструюванні діагностичних і профілактичних препаратів (Василье-в Б. Я. та ін., 1991) .

Розвиток генно-інженерного підходу в створенні RV вакцин знайшло своє відображення в спробах моделювання так званих субодиничних вакцин.

Використання ВПЛ як кандидат-вакцин, індукують захисний ефект у прищеплений, пройшло певний еволюційний шлях. Спосіб отримання вакцинного препарату на основі VP6 послужив предметом заявки на винахід (Sahara М. et al., Патент США, 1990).

Автори сконструювали препарати, які містили епі-тупни молекули, зчеплені з білковим носієм з мономерів або олігомерів поліпептидів гомологічних VP6, які формували ВПЛ. Ген VP6 виділяли за допомогою рекомбінантних плазмід і потім комплексірованние з різними полипептидами RV.

Раніше було показано, що білок внутрішнього капсида VP6 має здатність до самосборке. На основі цього феномена в даний час реалізована можливість отримання вірусоподібних частинок (ВПЛ) для імунізації тварин. RV гени, що кодують структурні білки, клонують в бакуловірусів і рекомбінантні RV білки коекспрессіруют в бакуловірусної систему (Estes М. К. et al., 1996 Crawford S. E. et al., 1994- Labbe M. et al., 1991). Експресовані RV білки самособіра-ються і утворюють ВПЛ. Коекспрессія різних комбінацій структурних білків призводить до формування ВПЛ з різним білковим складом.

Дані останніх років показали, що парентеральневведення инактивированного RV лабораторним тваринам призводить до їх повної захисту від гомологичного перорального зараження, що дало можливість оцінити шанси альтернативного шляху вакцинації за допомогою ВПЛ.

За допомогою клонування і експресії в бакуловірусної системі структурних білків VP4, VP6 і VP7 RV ВРХ (штам С 486) Redmond М. et al. (1993) були отримані ВПЛ, що містять на основі VP6 або VP4, або VP7. У дослідах на мишах сконструйовані ВПЛ викликали освіту гуморальних антитіл, що виявляються методом ІЕМ. Однак тільки ВПЛ з VP4 викликали утворення антитіл, що нейтралізують вірус і гальмують гемаглютинацію. Зараження мишей, імунізованих ВПЛ з наявністю VP4, виявило захисний ефект проти гомологичного (С 486) і гетерологічного (SA-11) RV. На відміну від цього потомство мишей, яка отримувала ВПЛ з наявністю тільки VP6, виявилося захищеним частково.

Надалі імуногенна активність і захисна ефективність парентерального введення ВПЛ різного складу (VP6 / 7, VP2 / 6/7, VP2 / 4/6/7) і ад`ювантов А1 ОН, QS21 була вивчена Conner М. Є. et al. (1996).

Автори конструювали ВПЛ різного складу в процесі ко-інфікуванні клітин SF9 (0,2 або 5 БОЮ на клітку) різними комбінаціями рекомбінантов бакуловірусів (Crawford S. Е. et al., 1994). Бакуловірусної рекомбінанти використовували в моделюванні ВПЛ, кодованих VP2 (RF) або VP6 (С 486) КРС- VP6, Р [2] VP4 або G3VP7 мавпи або Gl VP7 (8697) HRV. ВПЛ були очищені в градієнті щільності хлористого цезію або 40% сахарози.

У процесі проведення випробувань ВПЛ різного складу рекомбінантов структурних білків дворазово вводили мишам (0,2-20 мкг) і кроликам (10-20 мг) з подальшим інфікуванням RV SA-11 і ALA. Виявилося, що кролики, вакциновані VP2 / 4/6/7 або VP2 / 6/7, индуцировали високий рівень RV сироваткових і копроантітел класу IgG, але не IgA, а індукція фекальних IgG асоціювалася з повною або частковою захистом від орального зараження RV ALA. Причому не було виявлено впливу будь-якого ад`юванта на інтенсивність імунологічної відповіді. У мишей були отримані аналогічні результати з тією різницею, що з застосуванням ад`юванта QS21 ВПЛ індукувати відповідь антитіл (за даними ІФА та PH), який можна порівняти з таким при імунізації RV SA-11. Інтенсивність імунологічних зрушень зависила від дози ВПЛ. Слід зазначити, що у мишей, імунізованих VP2 / 6/7 або VP2 / 4/6/7, були виявлені також і гетеротіпіческіе сироваткові і копроантітела. Цей факт особливо важливий тим, що показує можливість зниження числа G-типів, що вводяться в субодиничних вакцину, а це, в свою чергу, передбачає можливість конструювання ВПЛ з обмеженим числом білків і тим самим зниження їх вартості. Що стосується ВПЛ VP6 / 7, то вони теж були імуногенність у мишей, але їх відносна нестабільність не сприяла розгляду їх як потенційних кандидатів в вакцину. В результаті проведених випробувань автори зробили висновок, що ВПЛ можуть забезпечити безпечну і ефективну альтернативу або доповнення до живої RV вакцині і для людей, і для тварин (Conner М. Т. et al., 1996, 1997).

Оцінці ефективності різних шляхів введення ВПЛ, а також їх складу і нового іммуноадьювантів присвячена робота O`Neal С. et al. (1997). Автори вивчили імуногенність та захисну ефективність перорального і интраназального введенні RV суб`едінічной вакцини, що містить VP2 / 6 і G3 2/6/7 в суміші з холерним токсином. Виявилося, що пероральне введення дорослим мишам зазначених ВПЛ индуцировало поява сироваткових і копроантітел класів IgG та IgA. Причому високі дози (100 мкг) ВПЛ сприяли захисту від подальшого RV зараження (gt; 50% зниження вірусовиделеніе) у 50% мишей.

Інтраназальний метод введення ВПЛ стимулював більш інтенсивну, ніж пероральний, вироблення сироваткових і місцевих антитіл. Миші, які отримали ВПЛ интраназально, були захищені від подальшого зараження, виділення вірусу після зараження відсутнє. Були відсутні і відмінності в імуногенності і захисний ефект між 2/6 і 2/6/7 ВПЛ. Слід підкреслити, що захист була досягнута без протективного антигенів VP7 і VP4.

Цікаві результати отримані при вивченні впливу іммуноадьювантів - холерного токсину на імуногенність та захисну ефективність ВПЛ. Інтраназальне введення VP2 / 6 без холерного токсину викликало освіту сироваткових і кишкових антитіл в більш низьких титрах в порівнянні з імунологічними зрушеннями при його застосуванні.

Використання високих доз (100 мкг) VP2 / 6 без ад`юванта стимулювало тільки часткове зниження вірусовиделеніе в середньому у 38% інфікованих мишей.

У той же час в аналогічних умовах імунізації і подальшого інфікування мишей високий рівень захисту при введенні ад`юванта був досягнутий з дозою іммуногена в десять разів меншою (10 мкг), ніж застосовувалася раніше. Таким чином, інтраназальне введення ВПЛ з іммуноадьювантів, на думку авторів, може служити прообразом безпеки не-реплицирующейся RV вакцини не тільки для тварин, але і для людей.

Поряд з холерним токсином (СТ) авторами в експериментальних умовах були також випробувані і температуро-чутливі токсини Е. Coli: LT і LT R129G.

Виявилося, що ВПЛ 2/6 із застосуванням всіх цих іммуноадьювантів индуцировали виражену захист мишей від подальшого RV зараження. Однак миші, що отримали ВПЛ 2/6 в поєднанні з ад`ювантом LT, продукували значно більш високі титри кишкових IgA антитіл в порівнянні з СТ. Всі миші, що отримали ВПЛ 2/6 з LT і LT R192G, були повністю (100%) захищені від RV зараження, тоді як з СТ - 91%. Іммуноадьювантів LT і LT 192G виявилися нешкідливими і ефективними імуностимуляторами, що дало авторам підставу рекомендувати їх для використання спільно з ВПЛ (O`Neal С. et al., 1998).

В якості нового напряму профілактики RV інфекції останнім часом були запропоновані ДНК вакцини, які кодують структурні білки RV (VP4, VP6, VP7) і володіють певним захисним потенціалом. При розробці вакцин останнього покоління крім іммуноадьювантів в їх склад вводять також комбінації убитих бактерій або їх антигенів, таких як малопатогенние сальмонели, а також цітомегалові-рус, поліовірус, аденовірус, вірус віспи.

Слід зазначити, що перспектива розробки та використання клонованих ентеробактерій (зокрема, кишкової палички), що містять в геномі ДНК-фрагменти RV людини, що кодують синтез вирусспецифических антигенів, обговорювалася ще в кінці 80-х років (WHO Drug Inf., 1989). Як векторної системи RV використовували вірус осповакціни (Poncet D. et al., 1990). В результаті генно-інженерної розробки був сконструйований рекомбінантний вірус осповакціни з вставкою в тімідінкіназний ген кДНК VP6 SA-11. Зараження цим рекомбінантов клітин МА 104 призводило до експресії VP6, який при імунізації мишей індукував утворення антитіл, що не володіли, однак, вируснейтрализующие активністю.

Імунна відповідь на експресуються рекомбінантним вірусом осповакціни чужорідні антигени можна істотно посилити шляхом «заякоріванню» останніх на оболонці інфіковані клітин. При цьому посилення імуногенності VP6 і VP7 може відбуватися як безпосередньо через В-клітини, так і шляхом активації Т-хелперів (Andrew М. et al., 1991).

У зв`язку з тим, що, як показали попередні спостереження, парентеральневведення RV вакцин забезпечує у мишей і кроликів захист від зараження (Conner М. Т. et al., 1993- McNeal М. М. et al., 1995), Herrmann IE et al. (1996 а) провели дослідження з обгрунтування можливості використання ДНК вакцин з метою профілактики RV інфекції. Ротавірусна ДНК вакцини були приготовлені шляхом включення комплементарної ДНК, що кодує мишачі VP4, VP6 або VP7, в експресуючий вектор (Yasutomi Y. et al., 1996). ДНК RV вакцину вводили під шкіру за допомогою так званої генної гармати (gene-gun).

Метод «gene-gun» полягає в тому, що ДНК вакцина адсорбується на золотих кульках (0,95 ммк), які вводяться в епідерміс за допомогою імпульсу гелію (Accell gene-gun- Agracetus, Middleton, WI). Цей метод є найбільш ефективним способом доставки необхідної кількості ДНК вакцини в епідерміс (Fynan Е. F. et al., 1993).

Плазмідні ДНК вакцини (VP4, VP6 і VP7) були оцінені в дослідах на дорослих мишах (BALB / c) за їхньою здатністю індукувати імунну відповідь і захист проти зараження RV EDIM. Виявилося, що дворазове введення мишам 0,4 мкг ДНК вакцин супроводжувалося підвищенням титрів IgG антитіл (за даними ІФА) в середньому до 1: 300 при використанні VP4 і VP7 і до 1 3200 - при імунізації VP6.

У той же час ВНА визначалися у мишей, які отримували живий вірус (EDIM), ДНК вакцини VP4 або VP7, але не у тварин, імунізованих VP6 ДНК вакциною. Поряд зі збільшенням титру гуморальних антитіл зростала і вміст антитіл класу IgA, причому найвищі показники спостерігали у мишей, вакцинованих VP6 ДНК. Для визначення клітинного імунітету вимірювали CTL активність. При співвідношенні ефектор-мішень 60: 1 відсоток специфічного лізису у мишей, інфікованих RV EDIM, дорівнював 57 ± 27%, а при вакцинації VP4 - 32 ± 14% - VP6 - 33 + 31% - VP7 - 42 ± 17% - плазмідний контроль ДНК - 2 ± 2%.

Таким чином, дворазове введення плазмідних ДНК вакцин VP4, VP6 і VP7 продемонструвало захист, подібну до тієї, яку спостерігали у мишей, які отримували перорально живий RV EDIM в дозі 100 ІД50- Herrmann J. et al. показали, що в механізм захисту залучений клітинний імунітет, IgA опосередкована внутрішньоклітинна нейтралізація неповноцінного вірусу або обидва ці чинника. Автори вважають, що досягнуті результати демонструють ефективність плазмідних VP4, VP6 і VP7 ДНК вакцин в стимуляції як специфічних антитіл, так і ЦТЛ (Herrmann J. et al., 1996 Chen S. C. et al., 1997). У той же час Choi A. et al. (1997) повідомили, що ДНК VP6, индуцируя високий рівень переважно сироваткових IgG, не спроможна забезпечити захист проти подальших заражень.

У роботах останніх років, присвячених вакцінопрофілакті-ке RV інфекції, з`явилися терміни «мукозальний вакцина» і «мукозальний імунітет». Мукозальние вакцини вводяться через слизові оболонки (перорально, інтраназально, Ентеральє-но і ін.) І містять спеціальні ад`юванти і антигени, укладені в мікрокапсули, що забезпечує їх захист від впливу травних ферментів і стійкість до низьких значень pH.

Метод микрокапсулирование RV базується на здатності іонносвязанних водорозчинних аніонних полімерів і аминогрупп підсилювати вироблення вірусспецифічного імунітету, що було продемонстровано Knoury С. A. et al. (1995), Brown К. A. et al. (1995). У мишей, імунізованих перорально інактивованих інкапсульованим і неінкапсулі-ванням мавпячим RV в дозах 1,75 або 0,35 мкг, визначали наявність специфічних антитіл в сироватці, вмісті кишечника і в органних культурах кишково-асоційованих лімфоїдних клітин (GALT). Виявилося, що вірусспеціфіческой IgA продукувались лімфоцитами lamina propria тонкого кишечника тварин, імунізованих обома дозами мік-роінкапсулірованного мавпячого RV. Миші, вакциновані неінкапсулірованний RV, виявилися іммунотолерантни. Тим самим автори продемонстрували, що мікрокапсулірова-ня може бути ефективним засобом індукції вірусспецифічного відповіді GALT після орального введення малої кількості вірусного антигену. Більш того, авторами була показана можливість мікрокапсульовані вакцини з певним терміном біодеградації надавати бустер-ефект. Слід підкреслити, що новий спосіб доставки вакцини захищає антиген від впливу ферментів кишечника і різних интерферирующих субстанцій, поставляючи його безпосередньо в Пейєрових бляшки (Estes М., 1996).

Таким чином, підбиваючи підсумки етапів розвитку вакцінопро-профілактики, необхідно відзначити, що найбільші успіхи в захисті від RV інфекції пов`язані з розробкою і багатоплановими випробуваннями живих полівалентних реассортантних вакцин, сконструйованих на основі сукупності чисто Дженні-ровского підходу і генно-інженерних технологій. В ході широких клініко-епідеміологічних спостережень, проведених в різних регіонах світу на контингентах дорослих і дітей різного віку, були показані їх нешкідливість, невисока реактогенність, висока імуногенна активність і ефективність у запобіганні RV інфекцій, а також у зниженні частоти важких клінічних форм захворювань і госпіталізацій .

Найбільш перспективними з полівалентних реассортантних вакцин є RRV-TV і WC3, які в даний час проходять заключні випробування перед ліцензуванням.

Поряд з вищевказаними вакцинами II покоління в останні роки сконструйовані нерепліцірующіхся суб`едінічние і векторні ДНК вакцини, що знаходяться на стадії доклінічній апробації.

Позитивні результати, отримані в умовах експерименту на тваринах, дають підставу вважати, що їх вивчення може бути продовжено на людях.