Вірусологічні дослідження. Кишкові захворювання. (Частина 3)

Всі перші набори були засновані на «сендвіч» -Принцип, наступні використовували «тандем» -варіанті. У процесі конструювання наборів проведені різні удосконалення, що стосуються як самої постановки ІФА і обробки Проб, так і застосовуються буферних систем. Наприклад, ряд авторів рекомендували застосування ЕДТА для зняття зовнішньої капсидний оболонки, що оголює групові антигени внутрішнього капсида. Інші пропонували обробку проб ІГЛ МЕМ з 0,5% гидролизатом лактоальбумінов і антибіотиками, що дозволяє застосовувати цей екстракт для виявлення вірусу на культурі тканини і в ПЕМ, що дає можливість використовувати один і той же зразок в різних методах дослідження. Дуже важливе значення має буферний розчин для проміжного промивання. Більшість з цих буферів містить соляний розчин з низькою концентрацією детергента, ТВИН-20 (Bryden A. S., 1990). Всі набори включають позитивні і негативні контролі. Як негативний контролю можуть використовуватися як буферні розчини, так і спеціальні негативні сироватки. Як позитивні контролів застосовують тестовані позитивні сироватки. Слід все ж зазначити, що інтерпретація результатів варіює від тесту до тесту. Головним показником того чи іншого набору є мінімальна реактивність або «cut-off», яка зазвичай використовується для визначення позитивного результату і є різницею між рівнем негативного контролю і позитивним рівнем, при цьому в ідеалі оптична щільність (ОД) негативного контролю повинна бути lt; 0,1. Однак на практиці цей показник коливається у різних тестів. Що стосується позитивного результату, то він може бути достовірний в переважній більшості випадків при показниках ОД gt; 0,5, т. Е. В кілька разів перевищує ОД негативного контролю. У той же час невелика частина зразків слабо реагує з ОД між «cut-off» і 0,5. Багато з них можуть бути негативні в ПЕМ, але більша частина - позитивна при ЕФ в ПААГ, ПЛР. Ці моменти необхідно брати до уваги при проведенні та облік ІФА.

У зв`язку з великою кількістю комерційних тест-систем з`явилася ціла серія робіт, присвячених визначенню їх порівняльної ефективності.

Слід зазначити, що перші комерційні тест-системи були далекі від досконалості за показниками чутливості і специфічності. Так, Gibchrist М. et al. (1987) на матеріалах від 136 хворих були визначені ці показники для 4 тест-систем ІФА: Rotavirus EIA, Pathfinder, Rotavirus Bioenzabead і Rotenzyme II, рівні 91%, 98%, 80%, 84% і 100%, 78%, 95 %, 88 / о відповідно. Виявлено невисока специфічність тест-систем Pathfinder і Rotazyme II, остання давала хибнопозитивні результати і за даними інших авторів.

З метою підвищення специфічності тест-систем дослідники стали використовувати моноклональні антитіла. Проведені випробування поліклональних і моноклональних антитіл показали перевагу останніх. Група авторів визначала показники діагностичної ефективності двох тест-систем, заснованих на моноклональних антитіл (Rotaclone, Pathfinder), і трьох систем на основі поліклональних антитіл (Rotavirus EIA, Rotazyme II, Wellcozyme Rotavirus Dennehy P. et al., 1998). При вивченні 100 проб калу від хворих гастроентеритом, перевірених в ЕФ в ПААГ, було показано, що обидві тест-системи на основі моноклональних антитіл відрізнялися максимальною (100%) чутливістю. Чутливість ж поліклональних тест-систем перевищувала 90% при коливаннях специфічності в межах від 55 до 100% (Dennehy Р. et al., 1988).

Flewett Т. et al. (1989) на матеріалах від 1163 дітей (в т. Ч. 66 новонароджених) порівнювали діагностичну ефективність тест-системи фірми Dakopatts і стандартної тест-системи ВООЗ. Чутливість і специфічність Dakopatts були рівні 97% в порівнянні з тест-системою ВООЗ. Причому при дослідженні матеріалів від новонароджених ці показники випробуваної тест-системи склали 100% і 98% відповідно.

Порівняльна оцінка інших тест-систем ІФА: Rotascreen, Wellcozyme, Rotazyme II і IDEIA показала, що тільки Rotascreen і IDEIA мали специфічність і чутливість більш 90% (Molyneaux Р. J. et al., 1989).

У зв`язку з даними про відставання специфічності ІФА від її чутливості були зроблені спроби вдосконалення методу, які дозволили поліпшити ці параметри. Порівняльне вивчення чутливості, специфічності, а також збігу позитивних і негативних результатів комерційних наборів VIDAS Rotavirus, Rotaclone і Pathfinder під контролем ПЕМ при дослідженні 464 копроматеріалов показали блискучі результати: VIDAS Rotavirus 98- 99,3, 98,7 і 99% - Rotaclone - 100 - 99- 98 і 100 Pathfinder - 100 92,4- 87,3 і 100% (Dennehy Р. Н. et al., 1994). Як видно з наведених даних, якісні параметри комерційних тест-систем стали настільки високі, що ряд дослідників (як нам здається, дещо передчасно) запропонували використовувати в якості референс-стандарту набір для ІФА Rotaclone, Cambridge Biosci. Corp. (Dennehy P. H. et al., 1990). Однак no думку більш обережних авторів, для отримання абсолютно точних даних необхідно поряд з ІФА застосовувати і інші методи дослідження: ПЕМ, ПЛР, ЕФ в ПААГ (Donneli G. et al., 1993- Husain М. et al., 1995 Markowsca- Daniel J. et al., 1996 Buesa G. et al., 1996 Dennehy PH et al., 1994- Jiang B. et al., 1995). Незважаючи на досягнуті успіхи в розробці тест-систем для ІФА, дослідження щодо їх удосконалення тривають. Так, Ribas-Antunez М. et al. (1998) провели порівняльну оцінку точкової ІФА і ЕФ в ПААГ при обстеженні 100 зразків копроматеріалов. Авторами була продемонстрована висока чутливість, специфічність і збіг результатів цих методів.

Поряд із застосуванням комерційних тест-систем успішні спроби розробки лабораторних наборів для ІФА були зроблені рядом авторів (Ruggeri F. et al., 1992 Husain M. et al., 1995 Buesa J. et al., 1996). Авторські лабораторні тести за основними показниками не поступалися комерційним тест-системам. Так, в Індійському національному інституті вірусології (Pune) був розроблений набір для діагностики ротавірусної інфекції (NIV), який був зіставлений з комерційним набором Dakopatts (Kelkar S. D., 1993). В процесі паралельного обстеження 63 проб виявилося, що NIV виявив 36 інфікованих осіб (57%), Dakopatts - 33 (52%) при 100% специфічності. Однак вартість лабораторного препарату була значно нижче інших комерційних наборів, що дозволило авторам запропонувати використання NIV в країнах, що розвиваються.

У нашій країні також налагоджений випуск вітчизняних комерційних тест-систем для ІФА: «Ротапаст» (С.-Петербург), «Rota антиген» (Н. Новгород), «Рота-аналіз» (Єкатеринбург). Чутливість і специфічність цих наборів, на жаль, поступається аналогічним показникам зарубіжних препаратів і становить 75%, при збігу позитивних результатів - 90%, негативних результатів - 86% (Карпович А. Г. та ін., 1991). У той же час в ряді лабораторій розроблені та апробовані власні тест-системи ІФА для діагностики ротавірусів: Букринская А. Г., 1988- Васильєв Б. Я. та ін., 1989- Рамішвілі-ли Л. Г. та ін., 1991 - Дзюблик І. В. та ін., 1990 Носатенко А. І. та ін., 1991).

Таким чином, високі показники чутливості і специфічності, швидкість проведення досліджень і можливість обліку результатів в автоматичному режимі забезпечують пріоритетність ІФА серед інших лабораторних методів діагностики ротавірусної інфекції. Слід зазначити, що ІФА застосовується не тільки для виявлення антигену, а й для типування виявлених вірусів. Такий широкий спектр можливостей методу робить його незамінним в будь-якій лабораторії.

Осадові тести містять всі діагностичні реакції, засновані на аглютинації частинок (еритроцити, латекс, бактерій), сенсибілізованих антигенами або антитілами, які здатні агрегироваться в присутності гомологічних сироваток або антигенів. При цьому частки виконують роль носіїв специфічних детермінант, його узагальнення є відбувається в результаті реакції антиген-антитіло, що реєструється візуально по наявності і характеру сформованого осаду. Внаслідок цього застосування осадових тестів дозволяє виявляти як антигени, так і антитіла.

Реакція гемаглютинації (РГА) заснована на здатності еритроцитів людини, різного виду тварин і птахів агглютинировать ротавіруси людини і тварин. Цю реакцію застосовували на початкових етапах вивчення та діагностики ротавірусної інфекції (Дроздова. Г. та ін., 1982). Пізніші дослідження показали, що не всі штами ротавірусів здатні агглютинировать еритроцити (Ezeqiel М. et al., 1995). У зв`язку з цим діагностична цінність цього методу стає сумнівною і в даний час РДА практично не використовується. У той же час є повідомлення про застосування реакції гемаглютинації в дослідженнях пошукового характеру, що стосуються визначення здатності еритроцитів людини і тварин агглютинировать ротавіруси різних груп, а також вивчення умов, при яких відбувається гемаглютинації (Devitt С. М., 1993). Роботи останніх років присвячені визначенню білків генома, відповідальних за гемаглютинацію і амінокислотну послідовність, що кодує цю здатність. В результаті вдалося встановити домен гемаглютинації, розташованої між 93 і 203 АА VP4 (Crawford S. et al., 1994- Ezeqiel M. et al., 1995).

Реакція непрямої або пасивної гемаглютинації (РИГА або РПГА) досить часто застосовується в лабораторній практиці (особливо в умовах невеликих лабораторій) при необхідності обстеження великих контингентів хворих і швидкого отримання результатів (Кравченко Т. М. та ін., 1991 Зарубінський В. Я. , Колпаков С. А., 1989- Закірова С. Ф. та ін., 1990 Васильєв Б. Я. та ін., 1987 1989- Гірін В. Н. та ін., 1991 Абенова У. А. і ін., 1991).

На відміну від РДА, в РИГА використовують еритроцити, сенсибілізовані ротавірусним антигеном. Традиційним об`єктом для сенсибілізації є еритроцити людини, барана і птахів - курей, індиків, качок. Приготовлені з еритроцитів птахів препарати осідають швидше, що дозволяє скоротити терміни проведення аналізу без втрати чутливості реакції. Процес прикріплення антитіл до еритроцитів здійснюється за допомогою цілого ряду реагентів, найбільш поширеними з яких є амідол і ВДВ (бідіазотірованний бензидин). Причому використання імуноглобулінів в сенсибілізації еритроцитів підвищувало ефективність діагностичного препарату (Чубова Н. В. та ін., 1991). У наших дослідженнях РИГА проводили з еритроцитарних діагностикумів за методикою, розробленою в Свердловському НІІВіВ.

Результати визначення ротавірусів в копроматеріалах показали, що чутливість РИГА склала 72% в порівнянні з 86% в ІФА, а збіг результатів під контролем ПЕМ і ІЕМ склала 100% (Васильєв Б. Я. та ін., 1989). Порівняння результатів РИГА з ПЕМ, ВІЕФ і РСК виявило більш високу чутливість РИГА (Тамендарова Н. Ч. і ін., 1989). Подібні дані і на матеріалах від 866 дітей, отримані при застосуванні РИГА, ПЕМ і ІЕМ (Зарубінський В. Я., Колпаков С. А., 1989). Виявилося, що чутливість РИГА була рівнозначна ПЕМ, а збіг між цими методами склали 96,6%. Порівнянні результати були отримані пізніше Абеновой У. А. і ін. (1961). Обстеження тисячу чотиреста п`ятьдесят вісім копроматеріалов дітей, госпіталізованих з RV інфекцією, за допомогою РИГА, РСК, ВІЕФ і ПЕМ виявило RV антиген в 35,8- 26,2- 18,2 і 39,8% зразків відповідно. Отже, РИГА продовжує застосовуватися в лабораторній діагностиці, але відсутність стабільних при зберіганні комерційних еритроцитарних препаратів ускладнює її широке використання з метою виявлення ротавірусних антигенів в матеріалах від хворих. Поряд з прямою РПГА в лабораторній практиці використовується метод зворотного РПГА, який застосовується для визначення RV в культурі клітин і копроматеріалах і в даний час (Tokieda М. et al., 1996 Kuzuya М. et al., 1998).