Вірусологічні дослідження. Кишкові захворювання. (Частина 4)

Застосування РКОА паралельно з ІФА та РАЛ показало близьку кореляцію результатів використаних методів (Zhang Y. et al., 1989- Pereira V. et al., 1992 Jap K. et al., 1992). Однак є відомості про появу неспецифічних реакцій з копроматеріаламі, які можна усунути попередньої адсорбцией суспензією стафілококів. У той же час, незважаючи на збіг результатів обстеження матеріалів РКОА і ІФА, чутливість її і специфічність виявилася нижче, ніж у ІФА і її можна порівняти з латекс-аглютинації (Jap К. et al., 1992).

Таким чином, результати застосування РКОА дозволяють рекомендувати її для діагностики ротавірусної інфекції в лабораторіях, де відсутня можливість використання більш чутливих і специфічних методів. Однак апробована останнім часом модифікація РКОА і радіоіммунопреціпітаціі з використанням білка А золотистого стафілокока дозволила значно підвищити чутливість і специфічність методу і вивчити імунологічний відповідь до VP2, VP6 і NSP2 в сироватках і копроматеріалах дітей з RV інфекцією (Colomina I. et al., 1998) .

Реакція аглютинації латексу (РАЛ) застосовується в лабораторній практиці в зв`язку з посиленням в останні роки тенденцією використовувати в якості носіїв антигенів і антитіл інертних синтетичних матеріалів. З цією метою використовують полістирольні латекси - синтетичні глобули зі стандартним розміром частинок близько 0,8 мкм. Більш дрібні за розміром частки (0,2-0,3 мкм) осідають в реакціях повільно і вимагають ультрацентріфугаціі в процесі приготування диагно-стікума, великі ж (gt; 1 мкм) часто дають неспецифічні реакції. Частинки латексу, попередньо адсорбовані антитілами (антигенами), набувають здатність агглютинироваться в присутності гомологічного антигену (антитіла) і візуалізують специфічний комплекс антиген-антитіло. З метою підвищення специфічності і чутливості методу латексні частинки можуть бути сенсибілізовані імуноглобулінами (Amer A. et al., 1990). У зв`язку з простотою і швидкістю проведення дослідження, а також низькою вартістю латекс-аглютинація використовується в лабораторній практиці досить широко: Ruggeri F. et al., 1992.

В даний час налагоджено випуск комерційних тест-систем для латекс-аглютинації, що послужило підставою для проведення робіт з порівняльної оцінки їх діагностичної ефективності.

Узагальнені результати оцінки РЛА та інших лабораторних методів виявили, що показники чутливості і специфічності РЛА в порівнянні з ПЕМ, ІФА, ЕФ в ПААГ були досить високі і дорівнювали 70-96% і 80-100% відповід ветствии (Santos N. et al. , 1989- Molyneaux PJ et al., 1989- Amer A. et al., 1990 Hendricks MK et al., 1995). Застосування моноклональних антитіл ще більше підвищувало діагностичну цінність РЛА (Dennehy Р. et al., 1988- Zbinden R. et al., 1992 Sanchez R. et al., 1993).

Поряд з комерційними латекс-системами дослідники застосовують і лабораторні тести, які дають зіставні з ними результати (Amer A. et al., 1990).

У той же час ряд авторів вказували на те, що застосування РЛА не позбавлене недоліків, так як дає певне число помилкових результатів. Так, при обстеженні 200 хворих дітей методами ІФА і РЛА виявлено 11 ложнонегатівних проб при показниках чутливості і специфічності рівних 86 і 95% відповідно (Amer A. et al., 1990). Пізніше інші автори при обстеженні 585 проб стільця хворих дітей методом РЛА і ЕФ в ПААГ отримали показники чутливості і специфічності рівні 96 і 100% відповідно. При цьому виявлено 6 помилково негативні і 3 хибнопозитивних результату на відміну від ЕФ в nAAT. (Zbinden R. et al. 1992). За даними Hendricks М. К. et al. обстеження 103 дітей у віці від 1 місяця до 5 років методами ПЕМ, ЕФ в ПААГ і РЛА показало, що чутливість цих методів дорівнювала 84, 90 і 80%, а специфічність 100, 100 і 81% відповідно. Автори виявили 15% хибнопозитивних результатів за даними РЛА (Hendricks М. К. et al., 1995), що може бути пов`язано при рота-вірусному гастроентериті з наявністю крові в досліджуваному матеріалі. У зв`язку з цим при отриманні позитивних реакцій в РЛА із зразками, що містять кров, результати слід інтерпретувати з обережністю і підтверджувати іншими методами (Bendall R. et al., 1991).

Таким чином, РЛА є найбільш просту діагностичну реакцію виявлення ротавірусів. Будучи цінним методом експрес-діагностики і володіючи високими показниками чутливості і специфічності, цей метод, однак, не має ніяких переваг перед ІФА, ПЕМ, ЕФ в ПААГ, крім швидкості проведення реакції, і потребує підтвердження іншими методами.

Резюмуючи матеріали, слід зазначити, що в цілому осадові тести знаходять широке застосування в лабораторній діагностиці ротавірусної інфекції у зв`язку з високою чутливістю і швидкістю отримання результатів, простотою постановки і обліку, а також відсутністю необхідності використання складного обладнання та дорогих реагентів.

Діагностичні методи, засновані на виявленні вірус-специфічних РНК. Розробка молекулярно-біологічних методів в вірусології привела до впровадження в практику ряду нових діагностичних тестів, заснованих на виявленні вірусних РНК. Їх використання відкрило можливість підходу до молекулярної епідеміології і дозволило вирішити деякі питання таксономії ротавірусів. Одним з перших діагностичних методів цієї групи став електрофорез вірусного генома в гелі.

Електрофорез вірусних РНК в поліакриламідному гелі (ЕФ в ПААГ) досить універсальний і широко поширений як в науково-дослідних, так і практичних лабораторіях. Завдяки своїй високій специфічності і чутливості він дозволяє вирішувати цілий комплекс проблем, пов`язаних з ротавірусної інфекцією, і знаходить застосування в діагностиці, епідеміології і профілактики. Можливість застосування цього методу обумовлена унікальним характером розподілу в гелі одинадцяти сегментів вірусного генома і великою стійкістю ротавірусної РНК до дії факторів навколишнього середовища. Існує кілька модифікацій проведення ЕФ в ПААГ. Незначно відрізняючись один від одного, всі вони засновані на екстракції РНК ротавірусів, разгонке виділених РНК в поліакриламідному гелі під впливом електричного поля і візуалізації результатів розгону РНК вірусного генома. Зміни можуть бути на кожному з цих етапів проведення ЕФ в ПААГ. Так, виділення РНК ротавірусу може проводитися безпосередньо з фекалій, минаючи стадію отримання очищеного вірусу- можливе попереднє поділ одно- і двунитчатую РНК, введення мітки 32Р, обробка досліджуваного матеріалу нуклеазами S1, яка руйнує однонитчатим РНК структури- варіює склад буферних розчинів, процентний вміст розділяє і концентрує геля- сила струму при електрофорезі, методи забарвлення. Час проведення дослідження становить 24-36 годин. В результаті на шпальтах гелю після його забарвлення нітратом срібла або етідіум-бром-будинок виявляються профілі вірусної РНК, відповідні 11 сегментам генома вірусу (Unicomb L. Е. et al., 1993- Assouli SM et al., 1995 Bos P. et al., 1995 Васильєв Б. Я. та ін., 1995 Szczepaniak Z. et al., 1996 Holmes JH, 1996 Steele AD et al., 1996 Markowska-Daniel J. et al., 1996 Espinoza F. et al., 1997 Adah M. et al., 1997 Wu H. et al., 1998).

При дотриманні стандартності умов проведення електрофорезу розташування сегментів геному досить стабільно і дозволяє ідентифікувати ізолят на основі індивідуальності його фореграмме. Слід зазначити, що характер розподілу сегментів геному на фореграмме є генетично стійкою ознакою, і будь-які зміни в амінокислотноїпослідовності генома тягнуть за собою зміну швидкості міграції вірусних білків (Kuzuya М. et al., 1996). Більш того, характер фореграмме, властивої певному ізолятів, може служити в якості інструменту для розшифровки спалахів, виявлення шляхів і джерел зараження (Oishi J. et al., 1993- Broor S. et al., 1993- Beque R. et al., 1992). До того ж, саме цей метод дозволив розділити ротавіруси на дві підгрупи з так званими «короткими» або «довгими» фо-ретіпамі (зумовленими меншою або більшою рухливістю 10 і 11 сегментів геному), що має принципове значення для класифікації RV популяції. Отже, ЕФ в ПААГ може бути з успіхом використаний в діагностиці, епідеміології, класифікації і по відношенню до цілого ряду методик (РАЛ, ГА, виділення вірусу на культурі клітин) - референс-методом.

Дослідження, проведені поруч авторських колективів, показали, що ЕФ в ПААГ має високу чутливість і специфічність. Порівняльне вивчення цих параметрів стосовно ЕФ в ПААГ, ПЕМ і РЛА, проведене при обстеженні 103 дітей, показало, що чутливість становила 90, 84 і 80%, а специфічність 100, 100 і 81% (Hendricks М. К. et al., 1995. ). Аналогічні дані, із залученням крім зазначених методів ще і ПЛР і ІФА отримані Buesa J. і Husain М. Правда, чутливість ЕФ в ПААГ, за даними цих авторів, дещо поступається результатами ПЛР і ІФА, проте специфічність складає 100% (Husain М. et al., 1995 Buesa J. et al., 1996). Подібні результати отримані і нами при дослідженні фекалій від 50 хворих ОКЗ методами ПЕМ, ІФА і ЕФ в ПААГ. Показники позитивних знахідок в ЕФ в ПААГ склали 28% проти 35% в ІФА і ПЕМ. Однак слід зазначити, що в трьох пробах, де ротавіруси в ПЕМ виявлені не були, за даними ЕФ в ПААГ зафіксована фореграмме, характерна для ротавірусу (Васильєв Б. Я. та ін. 1990). Пізніші наші дослідження, проведені на матеріалі 510 хворих ОКЗ з використанням ІФА, ПЕМ і ЕФ в ПААГ, дозволили нам підтвердити ротаві-РУСН етіологію захворювання в 37 і 23% відповідно (Васильєв Б. Я. та ін. 1995).

Maldonado A. et al. (1998) при порівняльному дослідженні копроматеріалов дітей, госпіталізованих з діареєю, методами ЕФ в ПААГ і ІФА документував RV природу захворювань в 42,7 і 49,5% відповідно.

Необхідно відзначити, що крім горизонтального застосовується і вертикальний електрофорез, який, на думку ряду авторів, можна порівняти з горизонтальним по специфічності і чутливості, але більш простий. При його проведенні для візуалізації результату автори пропонують включати бромистий ці-дій безпосередньо в гель і використовувати один і той же гель для кількох досліджень. Ними також було сконструйовано пристрій з ультрафіолетовою підсвіткою, що дозволяє легко і зручно читати фореграмме (Zbinden R. et al., 1992).

Модифікацію вертикального електрофорезу з візуалізацією фореграмме методом сріблення запропонували Giardano М. О. et al. (1997). Отримані ними дані показали, що нова модифікація чутливіші, специфичнее і дешевше, ніж загальноприйнятий ЕФ в ПААГ.

Таким чином, метод ЕФ в ПААГ в даний час знайшов широке застосування в лабораторіях різних країн для діагностики RV. Численні порівняльні випробування цього методу з ПЕМ, ІЕМ, РАЛ і ІФА свідчать про його високу специфічність і чутливість, а також можливості застосування ЕФ в ПААГ як референс-методу при вивченні нових тест-систем. Використання електрофорезу в поліакриламідному гелі з метою виявлення джерел інфекції і шляхів її поширення, а також розшифровки етіології епідемічних спалахів стало основою для успішного вирішення актуальних питань молекулярної епідеміології.

Процес перенесення білків (Western-blot) або нуклеїнових кислот (Dot-blot або Northern-blot і Southern-blot) з електрофоретичної матриці і їх іммобілізація на поверхні твердої фази називається блотингу, а отриманий відбиток - блотом. При аналізі блотограмм за допомогою імунних сироваток метод називають иммуноблотинга.

Як зондів зазвичай використовують або РНК, транскрибоване in vitro на матриці вірусного генома, або клони комплементарної ДНК, отриманої на матриці вірусного генома з використанням зворотної транскриптази і подальшим молекулярним клонуванням. Раніше мітку зондів здійснювали ізотопами 125J або 32Р, але в останні роки застосовують нерадіоактивні мітки - біотин або ферменти (лужна фосфатаза, пероксидаза та ін.), Що істотно спрощує метод, оскільки знімає питання изотопной безпеки. У цьому випадку результати реакції фіксуються у вигляді кольорових плям, що утворюються під впливом ферменту на додається субстрат, що свідчить про гібридизації зонда з РНК вірусу в досліджуваному матеріалі.