Вірусологічні дослідження. Кишкові захворювання. (Частина 1)

Виділення вірусу. Виявлення вірусного агента - збудника патологічного стану є одним з основних доказів у тріаді Коха причинності виникнення інфекції. У зв`язку з цим виділення вірусу надзвичайно важливо і є основоположною ланкою в ланцюзі заходів з лабораторної діагностики ротавірусної інфекції. До того ж вірусовиделеніе залишається одним з небагатьох методів, застосування яких може супроводжуватися виявленням нових вірусних агентів-збудників невідомих в даний час вірусних захворювань. Тому виділення вірусу на різних біологічних моделях (в більшості випадків - культура клітин) практикується надзвичайно широко. В даний час в якості біологічної моделі найбільш часто використовується цілий ряд клітинних культур: МА104, 4647, GBK, НТ-29, CV1, Vero, Сасо-2 та ін. (Рамішвілі Л. Г. та ін., 1991 Хапчаев Ю. X. та ін., 1989- Clark N. et al., 1988- Konno T. et al., 1993- Ward R. et al., 1990 Bernstein D. et al., 1989- Sato K. et al. , 1995- Weber B. et al., 1992 Markovska-Daniel J. et al., 1996 Shinozaki K. et al., 1996 Superti F. et al., 1997).

Виділення вірусу на клітинних культурах проводять в 2 етапи: зараження вірусом клітинних культур (I) і документування його репродукції по появі ЦПД або за допомогою ІФА, ІФМ, ПААГ, ПЛР, ПЕМ і методу плякообразованія (II). У зв`язку з особливою важливістю цього методу ми дозволимо собі деяку деталізацію. Проби калу забирають в перші 2-3 дні захворювання в стерильну лабораторний посуд і транспортують в контейнерах з льодом або іншим холодоагентом. Досліджуваний матеріал необхідно обробити відразу після доставки в лабораторію або зберігати при мінусовій температурі. Перед початком вірусологічних досліджень проби розморожують, забирають 0,5-1 г фекалій і додають живильне середовище (Ігл, Ерл, Хенке) в кількості, необхідній для отримання 10% суспензії. Суспензія гомогенезируют до однорідного стану багаторазовим енергійним струшуванням (з намистом або без них) або заморожуванням і розморожуванням. Гомогенізація суспензії струшуванням є більш щадить, т. К. Заморожування та відтавання вірусосодержащего матеріалу призводить до деструкції VP7 (Nirdnoy W. et al., 1995). Далі суспензію центрифугують 10-15 хвилин при 1000-2000 g, звільняють від осаду і надосадову рідину розливають але 1 мл для проведення вірусологічних досліджень або зберігають при -20-70 С в залежності від терміну зберігання. Після цього вірус активують протягом 30 хвилин при 37 ° С трипсином в концентрації 10 мкг / мл і центрифугують протягом 2 хвилин при 15000 g. Потім чотиридобове моношар двічі відмивають ДМЕМ і заражають 1-2 lg (10-30 вірусних частинок на клітку) активованим RV на живильному середовищі (ДМЕМ, Ігл МЕМ, Хенкса), що містить 10% -ю телячу ембріональну сироватку і антибіотики. За даними різних авторів, використовували 100-500 од. пеніциліну, 100-500 мг стрептоміцину, 40 мг гентаміцину і 50 од. нистатина в 1 мл. Після 2-годинної адсорбції при 37 ° С клітини відмивали і наносили ДМЕМ, що містить антибіотики і 4-13 мкг / мл трипсину (Clark Н. et al., 1988- Sato К. et al., 1995).

Позитивний вплив трипсину на процеси реплікації ротавірусів показали і Konno Т. et al. (1993). Автори підтвердили, що трипсин активує продукцію вірусу, вибірково впливаючи на функцію VP4 і зовнішнього капсидних білка, дезінтегріруя їх. Це призводить, з одного боку, до зниження гемаг-глютінірующей активності вірусу, а з іншого - до посилення проникнення вірусу в клітину, т. К. Оброблені трипсином віріони проникають в клітку і реплікуються в ній, а необроблені - піддаються ендоцитозу і не реплицируются. Таким чином, застосування трипсину в дозі від 0,1 до 10 мкг / мл призводить до підвищення інфекційності вірусу. Заражену культуру клітин спостерігають протягом 5-7 днів. Поява ЦПД свідчить про наявність вірусу, який потім документують ПЕМ, ЕФ в ПААГ або із застосуванням антисироваток - ІЕМ, ІФМ і ін.

При відсутності ЦПД культуру заморожують і роблять додаткові пасажі в тих же умовах за винятком того, що вірус активують обробкою трипсином 4 мкг / мл при кімнатній температурі протягом 2 годин.

Починаючи з 4 пасажу, ЦПД зазвичай виявляють через 4-5 днів після зараження (Ward R. et al., 1990 Bernstein D. et al., 1989).

Однак внаслідок низької чутливості клітинних культур до природних ізолятів, рутинним діагностичним методом вірусовиделеніе при ротавірусних гастроентеритах не стало. З огляду на те, що неадаптованих до клітин ізолят може репродукуватися в них без ЦПД, виявлення вірусу додатковими методичними прийомами істотно підвищує ефективність даного методу. Підтвердженням цьому служить дослідження, проведене Weber В. et al. (1992). Автори поряд з виявленням ротавірусу по ЦПД провели порівняльне вивчення декількох методів детекції ротавірусів в заражених клітинах, дослідивши 121 пробу калу від дітей з гастроентеритом у віці до 3 років. Стандартне виділення в клітинах МА-104 під контролем ЦПД виявило лише 3,3% позитивних знахідок, тоді як застосування імунопероксидазному мітки підвищило рівень діагностики до 40,5%, а використання ІФА і ЕФ в ПААГ - до 54,4% і 46,3 % відповідно.

Оскільки HRV не завжди викликає ЦПД і реплицируется в звичайних клітинних культурах, Genthe В. et al. (199Ц після 18 годин культивування в МА-104 виявляли вірусний внутрішньоклітинний антиген ІФА при використанні антисироваток, мічених пероксидазою. Порівняння цітоіммунной техніки мічених антитіл з комерційними тест-системами для постановки, ELISA і латекс-аглютинації показало, що цітоіммунний метод в 10 разів чутливіші.

Аналогічні результати отримані в роботах останніх років. Так за даними Markowska-Daniel J. і ін., Методом ІФА ротавірус в фекаліях було виявлено в 32% випадків. Застосування культури клітин МА-104 і документування репродукції вірусу ІФМ, ПЕМ і ЕФ в ПААГ підвищило відсоток виявлення вірусу до 64,0% (Markowska-Daniel J. et al., 1996).

Класичним субстратом для репродукції ротавірусів є клітинна лінія нирок мавп МА-104, яка використовується найбільш часто, причому не тільки в діагностичних, але і дослідницьких цілях (Johansen К. et al., 1997 Kobayashi N. et al., 1995), а також у ветеринарній практиці (Gulati В. et al., 1997). Показано, що МА-104 підтримує репродукцію ротавірусів не тільки групи А, але і С за умови утримання в культуральному середовищі трипсину у високій концентрації (Tsunemitsu Н. et al., 1991). Однак, з огляду на недостатню чутливість клітин до ротавирусам, проводиться як пошук інших ліній, клітин і методів, придатних для виділення та репродукції ротавірусів, так і розробка способів підвищення чутливості клітин до ротавирусам. Виявилося, що лінія клітин карциноми прямої кишки людини НТ-29 була більш чутливою, ніж МА-104 при виділенні ротавірусів людини. На відміну від МА-104 на НТ-29 виявляється зростання ротавірусів в перший або наступний пасажі, навіть якщо відсоток інфікування клітин залишався низьким (Superti F et al., 1991, 1997).

Інша лінія клітин карциноми товстого кишечника Сасо-2 також використовується для виділення RV. За допомогою цієї лінії клітин в присутності трипсину (4 мкг / мл) був ізольований RV групи С в Японії, який репродукувати без ЦПД і був документований ПЕМ, ІЕМ, ІФМ і зворотного РПГА (Shinozaki К. et al., 1996).

Клітини лінії нирки великої рогатої худоби, GBK також дали більш високі результати при титруванні ротавірусів, виділених від телят (на 1-2 lg вище, ніж в клітинах МА-104). Слід зауважити, однак, що клітини обробляли попередньо діетіламіноетілдекстраном в дозі 50 мкг / мл і в підтримуючу середу вносили трипсин в концентарціі 5 мкг / мл (Konno Т. et al., 1993).

Підвищення чутливості клітин до вірусів взагалі і ротавирусам зокрема досягається використанням для цієї мети хімічних і фізичних методів. Показано, що центрифугування, постійне погойдування або різке температурний вплив (тепловий шок) сприяють зростанню числа уражених клітин, збільшення врожаю вірусу або підвищення рівня вірусовиделеніе в діагностичних вірусологічних дослідженнях. З хімічних засобів впливу слід зазначити ефективність диметилсульфоксида, який підсилює процес трансформації заражених вірусом клітин, збільшує число Пляка і їх розмір, підвищує урожай вірусу (Hyghes J. Н., 1993). Більш тонка ідентифікація вірусу може бути досягнута за допомогою бляшок, що утворюються під його впливом в культурі тканини. Метод отримання бляшок розроблений Dulbecco R. (1952) в різних модифікаціях широко застосовується і в даний час. Принцип методу полягає в тому, що розведення вірусної суспензії наносять на одношарові тканинні культури в чашках Петрі, плоскостенних флаконах, в лунках пластмасових пластин. Після адсорбції вірусу на клітинах їх покривають шаром живильного агару. Завдяки агарові покриттю, розмноження і поширення вірусу обмежується тільки спочатку інфікованими і сусідніми з ними клітинами. Таким чином утворюються органічні вогнища клітинної дегенерації - так звані «бляшки» (Пляка). Зазвичай вони виявляються фарбуванням шару клітин прижиттєвим барвником - нейтральним червоним, який або включають до складу агарового покриття, або наносять на нього безпосередньо перед урахуванням результатів. Бляшки НЕ адсорбируют барвник і тому приймають вид світлих плям на тлі забарвлених живих клітин (Tosser J. et al., 1994).

Для виявлення бляшок крім нейтрального червоного можуть бути застосовані й інші барвники, як, наприклад, кристалічний фіолетовий. Одна інфекційна частка вірусу утворює окрему бляшку, що дозволяє застосовувати бляш-кообразованіе як точного методу для кількісного дослідження інфекційності вірусу і вимірювання нейтралізаційних активності антитіл. Використовуючи бляшки, вірус можна очистити, т. Е. Отримати його чисті лінії (Isa Р., Snodgrass D. 1994- Ward R. et al., 1998). При проведенні такого очищення шар клітин після адсорбції на ньому вірусів потрібно ретельно відмити від адсорбованих вірусних частинок і лише після цього нанести агарове покриття. Слід зазначити, що застосування диметилсульфоксиду, діетіламіноетілденетрана (ДЕАЕ), трипсину надає стимулюючу дію на утворення бляшок (як і зниження концентрації агару в покритті).

Шгапо N. et al. (1987) використовували метод отримання бляшок для виявлення ротавірусу ВРХ у новонароджених телят, порівнюючи дві лінії клітинних культур МА-104 і GBK (ниркових клітин ВРХ). Підтвердивши можливість використання клітин МА-104, вони запропонували використовувати для цієї ж мети лінію клітин GBK і розробили свою модифікацію методу бляшкоутворення. У пластикові чашки Петрі діаметром 6 см сіяли 0,8-1,0 х 106 клітин в 5 мл ростової середовища. Через 2-3 дні після освіти монослоя клітини промивали і вносили 0 2 мл ротавірусу (штам Лінкольн), розведеного культуральної середовищем з 50 мкг / мл ДЕАЕ. Після 90 хвилин інкубації при 37 ° С нашаровуються 5 мл культурального середовища з 0,8% агару, 10% тріптозно-фосфатного бульйону, 5 мкг / мл трипсину і 50 мкг / мл ДЕАЕ. Через 3 дні, нашаровуються друге покриття, що містить нейтральний червоний в кінцевому розведенні 1: 5000. Через 6-8 годин підраховували чісйо бляшок.

Іншу модифікацію отримання бляшок використовував Bernstein D. et al. (1989) при вивченні виділення вакцинного штаму у дорослих волонтерів, щеплених ротавірусної вакциною WC 3. Для цієї мети 1 мл попередньо обробленої, як було описано вище, проби стільця інкубували 30 хвилин при температурі 37 ° С з 10 мкг трипсину і нашаровуються на моношар МА 104, двічі відмитий збалансованим розчином Ерла. Після 1 години адсорбції при 37С моношар ще раз відмивали і заливали середовищем ДМЕМ з антибіотиками, 4 мкг / мл трипсину, 25 мкг / мл ДЕАЕ і 0,2% агарози і інкубували 4 дня при 37 С. Після видалення середовища нашаровується друга агарове покриття з кристал-Віолета для візуалізації Пляка.

В даний час візуалізація Пляка досягається за допомогою імунофлуоресцентного методу або радіоактивності, що збільшує як специфічність методу, так і його чутливість (Isa Р. et al., 1994).

Таким чином, вірусовиделеніе залишається важливим методом підтвердження етіології захворювання, але в даний час з огляду на можливості використання широкого набору сучасних діагностичних методик застосування його в якості рутинного діагностичного тесту, мабуть, недоцільно.

Електронна мікроскопія RV. Виявлення вірусу методом електронного микроскопирования проводиться в двох модифікаціях: пряма електронна мікроскопія (ПЕМ) і іммунноелектронная мікроскопія (ІЕМ).

Відомо, що в перші дні захворювання зміст ротавірусу в копроматеріалах досягає таких кількостей, при яких можливо його виявлення під електронним мікроскопом в Ю-20% суспензії без додаткової концентрації. Після осветляющего центрифугування суспензії кілька крапель надосадової рідини контрастують розчинами фосфорновольфрамовой кислоти (1-2%), ацетату уранила (0,25-1%) або молібдату амонію (1%) і наносять на предметні електронномікроскопіческіе сітки. Дослідження препарату проводять в електронному мікроскопі при збільшенні 50 000. Належність виявлених часток до ротавирусам визначають за розмірами і характерною морфології.

Метод прямої електронної мікроскопії (ПЕМ) в різних модифікаціях застосовується для діагностичних і дослідницьких цілей досить широко (Васильєв Б. Я. та ін., 1989, 1995, 1996 Зарубінський В. Я. та ін., 1989- Хаустов В. І. `і ін. 1989- Шелковська Н. Г. та ін., 1991 Dennehy Р. et al., 1990 Donneli G. et al., 1993- Zeng C. et al., 1994- Oishi J. et al. , 1993- Gonzalez S. et al., 1995 Hendricks MK et al., 1995 Jiang B. et al., 1995 Buesa J. et al., 1996 Tinari A. et al., 1996 Andrade GP et al., 1997 Superti F. et al., 1998).