Вірусологічні дослідження. Кишкові захворювання. (Частина 5)

Прикладами використання Western-blot для вивчення структури білків RRV-2, SA-11, DS-1 служить робота Павлова та ін. (1991). Застосувавши гіперімунні сироватки, автори за допомогою імуноблоту провели аналіз VP1, VP2, VP4, VP7 - еталонних штамів ротавірусів мавпи і людини. Пізніше Zeng Q. et al. (1994), застосувавши методику Western-blot з подальшим використанням моноклональних антитіл для імуно-блотингу, вивчили функції VP2, SA-11, механізм складання частинок VP2, VP2 / 6 і транспорт метаболітів всередині ядра.

Найбільш поширеним способом молекулярної гібридизації є РНК-РНК гібридизація як в Dot-blot, так і в Northern-blot. Dot-blot (точкова гібридизація) є найбільш простим варіантом молекулярної гібридизації, що дозволяє кількісне визначення вірусних нуклеїнових кислот. Northern-blot - варіант молекулярної гібридизації, при якому розділені нуклеїнові кислоти витягують з електрофоретичної матриці, переносять і иммобилизируют на поверхню твердої фази в тій же послідовності, як вони знаходяться в гелі. У той же час, використання в Dot-blot`e і Northern-blot`e зондів до окремих генів ротавірусу, в тому числі VP7 і VP4, дає можливість типировать ізоляти безпосередньо в матеріалах від хворого.

Метод молекулярної гібридизації використовується в діагностиці ротавірусної інфекції (Новікова Н. А. і ін., 1991, 1998 Красько А. Г. та ін., 1991 Гіневскій В. А. та ін., 1992 Fer-nandoz J. et al., 1992 Steele et al ., 1996- Husain M. et al., 1996), але частіше для вирішення таких завдань, як типування ізоляту, вивчення атипових штамів, міжвидової і груповий реассортаціі, при проведенні досліджень в галузі молекулярної епідеміології, а також міжвидової і груповий реассортаціі (Gorrell RY et al., 1996 Kuzuya M. et al., 1996 Nakagomi 0., Nakagomi T., 1991 (а, в) - 1996- Ward R., 1990, 1991 Qian Y. et al., 1991 Palombo E. et al., 1998).

Принципова можливість застосування точкової гібридизації для діагностики RV інфекції людини була продемонстрована Красько А. Г. та ін. (1991). Як зондів використовувалися 32Р-мічені сегменти геному RV свиней, транскрибоване in vitro шляхом активації ендогенної РНК-зави-сімою РНК-полімерази, причому транскрипти були отримані до всіх 11 сегментам RV.

Застосування цього методу з використанням в якості зонда РНК RV SA-11, також мічену 32Р, дозволило Новікової Н. А. і ін. (1991) виявити РНК RV в носоглоткових змивах 29 (76,3%) з 38 хворих РВГЕ, що підтверджує можливість транскрипції генома RV в клітинах слизової оболонки носоглотки.

Діагностична цінність РНК-РНК гібридизації була продемонстрована Fernandoz J. et al. (1992) при обстеженні 303 проб стільця від хворих РВГЕ методом Dot-blot. Олігонуклео-тидной зонд складався з 40 нуклеотидів ділянки 33-72 гена VP7, найбільш консервативного у багатьох ротавірусів. В якості мітки використовували біотин (біотин-7 дАТФ). Поряд з Dot-blot застосовували ЕФ в ПААГ і ІФА. Всього було виявлено 230 позитивних випадків, підтверджених точкової гибридизацией і ЕФ в ПААГ. Менш надійним виявився ІФА, який виявив 7 хибнопозитивних і 12 помилково негативні зразків. Чутливість методу склала 200 пг (Fernandoz J. et al., 1992). Роздільна здатність Northern-blot була вище і дозволяла виявити до 6,0 пг гомологичной РНК, причому зонди не реагували навіть з 100 нг гетерологичной РНК (Ali А. et al., 1993).

Використання специфічних зондів до різних G- і Р-типам відкрило можливість отримати чітку картину циркуляції ротавірусів в різних географічних зонах (Sethabuthz О. et al., 1992 Husain М. et al., 1996 Correll RY et al., 1996 Isa P. et al., 1996 Adah M. et al., 1997).

РНК-РНК гібридизація дозволила документувати наявність груповий реассортаціі, яка відбувається в природних умовах, а також при культивуванні ротавірусів, що відносяться до різних геногрупи, на культурі клітин (Ward R., 1990 1991).

Цей метод здатний також більш точно охарактеризувати приналежність того чи іншого вірусу до певної групи. Відоме поділ ротавірусів на I і II підгрупи на сучасному етапі не зовсім відповідає дійсності, т. К. Не всі ізоляти укладаються »в уже відомі характеристики. Так, наприклад, штам AU-1 не відповідає характеристиці підгрупи I, володіючи проте довгим форетіпом. Тільки використання даних РНК-РНК гібридизації дозволило виділити цей штам і подібні до них ізоляти в окрему групу (Nakagomi О., Nakagomi Т., 1991 (а, в) - 1992). Більш того, РНК-РНК гібридизація класифікує ротавіруси на генетичному рівні (т. Н. Genogrouping), що особливо цінно для вивчення атипових ротавірусних ізолятів (Nakagomi О., 1996).

Поряд з РНК-РНК гибридизацией показана можливість використання РНК-ДНК гібридизації (Southern-blot). З цією метою методом зворотної транскрипції були отримані комплементарні ДНК (до ДНК) до різних сегментів геномної РНК. Було показано, що найбільш ефективна гібридизація спостерігається при використанні в якості зонда кДНК до сегменту 3 генома RV. В якості мітки використовували 32Р. Ефективність Dot-blot РНК-ДНК гібридизації склала 0,5 нг. При цьому спеціальними дослідженнями було показано, що використовуються кДНК-зонди не дають перехресних реакцій з РНК RV інших груп (Eiden J. et al., 1989).

Слід зазначити, що проведення точкової РНК-ДНК гібридизації для диференціації серотипів в присутності 50% формамід робить цю реакцію строго специфічною (Rosen В. et al., 1990). Причому проведення реакції гібридизації можливо не тільки з олигонуклеотидами, міченими 32Р, а й лужною фосфатазою (ЛФ). Причому використання обох міток при дослідженні 148 проб методом РНК-ДНК гібридизації показало подібні результати (Sethabutr О. et al., 1992).

Southern-blot знайшов широке застосування у виявленні ротавирусного генома і в навколишньому середовищі. За допомогою РНК-ДНК гібридизації RV був виявлений в питній воді, в грунті, стічних водах (Гіневскій В. А. та ін., 1992 Zothikumae N. et al., 1995 Grinde В. et al., 1995 Dubois E . et al., 1997).

Таким чином, методи гібридизації характеризуються незмірно більш високу чутливість і специфічність, ніж лабораторні тести, і з успіхом можуть бути використані в якості еталону для їх оцінки. Вони є універсальним методом діагностики та типування ротавірусів і дозволяють проводити типування ізолятів безпосередньо в матеріалах від хворих.

В останні роки на основі новітніх досягнень генної інженерії і біотехнології розроблений унікальний метод діагностики вірусних інфекційних захворювань з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). На відміну від стали вже традиційними методів ІФА, блот гібридизації, що забезпечують надійну детекції 0,1-10 млн молекул-мішеней (антигенів або нуклеїнових кислот), метод ПЛР дозволяє виявити лише одну молекулу нуклеїнової кислоти в пробі.

ПЛР заснована на двох основних властивостях нуклеїнової кислоти - можливості поділу синтезуються подвійних ланцюгів геномної ДНК і повторного синтезу на їх основі комплементарних нуклеїнових структур.

Для проведення реакції з досліджуваної проби за допомогою протеїнази К і фенол-хлороформу виділяють нуклеїнові кислоти (Oischi J. et al., 1993- Gouvea V. et al., 1991). У зв`язку з необхідністю застосування таких токсичних речовин, як фенол, хлороформ, фреон, в подальшому був розроблений метод виділення та очищення двунитчатой РНК, заснований на використанні гуанідінізотіоціаната, гідрооксіапатіта і цетілтрі-метил амонію бромистого (Santos N., Gouvea V., 1994) . Метод простий, ефективний, дозволяє звільняти РНК від інгібіторів ферментів і дає більший вихід вірусних РНК. Денатуровані методом відпалу (90 ° С) нуклеїнові кислоти поміщають в середу з додаванням нуклеотидних праймерів і термостійкою ДНК-полімерази. При 36 "З на окремому ланцюгу ДНК за допомогою ДНК-полімерази синтезується комплементарна їй структура. Праймери визначають, яку ділянку РНК буде репродукований, а додавання стоп-кодонів призводить до того, що полімеризація йде не по всій довжині ланцюга ДНК, а тільки на одній ділянці ланцюга, відповідальної за певні функції генома, т. Е. Групових, типо або сероспеціфіческіе послідовності генома. Потім температуру підвищують до 58-60 ° С, в результаті чого синтезована подвійна нитка розпадається. Далі температуру знижують до 36 ° С, і синтез комплементарних ланцюгів повторюється вже на двох розділилися ланцюгах і т. Д. В результаті багаторазового повторення цієї процедури число строго специфічних для кожного збудника нуклеотиднихпослідовностей зростає на кілька порядків. Теоретично питання про чутливість просто знімається, оскільки в цьому випадку з одного ланцюга можна отримати 1000-кратне накопичення нуклеотиднихпослідовностей. Цей не вимагає радіоізотопів метод виявився в 1 000 000 разів чутливіші стандартного методу з використанням електрофореті-пов днРНК - сегментів геному і в 5000 разів чутливіші методи молекулярної гібридизації (Xu L. et al., 1990). За даними Eiden J. et al. (1991) чутливість ПЛР в рутинних дослідженнях наближається до фемтоколічествам (більше 80 фг).

Слід зазначити, що в якості вихідної молекули для ПЛР може бути використана ДНК або кДНК, отримана за допомогою попередньої обробки РНК зворотної траскріп-тазой з подальшою амплификацией. РНК витягають як з свежеполученной клітин, тканин, так і заморожених, ліофіл-лізірованіе або фіксованих препаратів, т. Е. Об`єктів, раніше недоступних для аналізу. Цей різновид ПЛР носить назву ревертазной назад транскріптаціонной полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР). Сутність цієї модифікації ПЛР полягає у використанні пари олігонуклеотних праймерів, здатних специфічно гибридизоваться з послідовностями нуклеотидів на протилежних кінцях двох ланцюгів ділянки ДНК. Як затравки для одночасного синтезу комплементарних ланцюгів використовують термостабільну ДНК-полімерази. Повторні цикли денатурації подвійної спіралі ДНК і добудови ниток після відпалу з праймерами призводять до експоненціального зростання кількості фрагментів ДНК, фланкирован послідовностями нуклеотидів, відповідних первинну структуру праймерів. В результаті 30-40 циклів ампліфікації кількість молекул ДНК в реакційній пробі збільшується в 108-108 разів, що дозволяє визначити 104 ЦПДво / мл і не дає перехресних реакцій з іншими вірусами (Kweon С. Н. et al., 1997). У той же час жодна з пар праймерів RV не реагувала в ОТ-ПЦР із зразками фекалій, що містять ротавіруси іншої групи, а також зі зразками від контрольних неінфікованих людей і тварин, що говорить про високу специфічність методу (Eiden J. et al., 1991).

Ампліфікаціонних послідовності можна побачити в УФ світлі, після фракціонування продуктів ПЛР за допомогою гель-електрофорезу в присутності бромистого етидію (Gouvea V. et al., 1991 Oishi I. et al., 1993). Отримана кількість фрагментів ДНК є достатнім для аналізу за допомогою інших молекулярно-біологічних методів: Dot-blot гібридизації, секвенування, клонування та ін.

В даний час здійснено підбір праймерів для виявлення ротавірусів групи А, В і С по генам 9, 8 і 6 відповідно (Gouvea V. et al., 1991 Oishi I. et al., 1993- Buesa I. et al., 1996. ). Метод ОТ-ПЦР використовують для визначення ротавірусів навіть в тих випадках, коли інші методи не дозволяють ідентифікувати їх (Ushijima Н. et al., 1992 Oishi I. et al., 1993- Jiang B. et al., 1995). У роботах останніх років наводяться дані щодо застосування ПЛР для G- і Р-серотипування RV. Автори показали, що найбільш часто виявляли у людей ротавіруси, що відносяться до типів G1-G4 і Р4, Р6, Р8 і Р10 (Taniguchi К. et al., 1992 Correll RJ, Palombo EA, 1996- Husain M. et al., 1996- Espinoza F. et al., 1997). Ці дані дозволяють швидко отримати детальну інформацію про молекулярні основи епідеміологічної варіації ротавірусів, що надзвичайно важливо як в епідеміології, так і в конструюванні ротавірусних вакцин (Richardson S. et al., 1998 Leite I. et al., 1996 Arista S. et al., 1997 Adah M. et al., 1997).

Незважаючи на велику кількість досліджень, які підтверджують високу специфічність і чутливість ПЛР, поруч авторів проведені порівняльні випробування цього методу з традиційними способами діагностики: ІФА, ЕФ в ПААГ, ПЕМ. Більш висока чутливість ПЛР у порівнянні з ІФА продемонстрована Wilde J. При обстеженні 40 дітей було отримано 103 проби стільця. В ПЛР виявлено 60 позитивних випадків (53%) у порівнянні з 37 (36%) в ІФА. Крім того, середня тривалість екскреції вірусу дорівнювала 9,5 дня за даними ПЛР, в порівнянні з 5,6 днями в ІФА (Wilde J. et al., 1991). Схожі результати, що свідчать про більш високу чутливість ПЛР у порівнянні з ІФА, отримані Tani-guchi К. При ідентифікації 115 копроматеріалов від хворих дітей автори встановили, що методом ПЛР діагноз підтверджений у 93% випадків проти 82,6 по ІФА. (Taniguchi К. et al., 1992).

Пізніші роботи повністю підтвердили ці результати. Так, при порівнянні ПЛР, ПААГ і ІФА, використаних для виявлення ротавірусів в матеріалах хворих дітей, відсоток позитивних знахідок склав: 94, 91 і 80% відповідно (Husain М. et al., 1995). Аналогічні результати отримані при обстеженні 220 хворих ОКЗ. Відсоток виявлення ротавірусу в матеріалах осіб, обстежуваних методами ПЛР, ІФА, ПААГ і ПЕМ, відповідно склав 30, 29, 26,8 і 25,4 (Buesa J. et al., 1996). За даними Masendyacz Р. et al., Показники чутливості і специфічності трьох методів виявлення RV в копроматеріалях діарейних хворих склали: ПЛР - 92 і 98% - РНК-ДНК гібридизація - 80 і 99% - ІФА - 73 і 81% (Masendyacz Р. et al., 1998).

Як показують представлені дані, аналіз ротавірусних РНК все ширше впроваджується в практику, незважаючи на певну складність і дорожнечу дослідження, і використовується як для діагностики, так і для характеристики патогена. Цей процес був інтенсифікований з розробкою ПЛР, найбільш чутливого і специфічного методу діагностики, який, на думку багатьох авторів, в даний час є «золотим стандартом», яким раніше була ПЕМ (Nakagomi О. et al., 1994- Masendyacz Р. et al ., 1998).

Таким чином, ПЛР є молекулярно-біологічний тест нового покоління, що відкриває великі можливості в класифікації, типування, загальної та молекулярної епідеміології ротавірусів. Однак слід зазначити, що ПЛР вимагає високої кваліфікації дослідників, дорогих реагентів і порівняно складного обладнання. У той же час, подальше вдосконалення методики, очевидно, зробить ПЛР більш доступною для широкого кола діагностичних лабораторій.

Підводячи підсумки застосування методів ідентифікації ротавірусів в різних об`єктах дослідження, слід зазначити, що практично кожен з розглянутих в цьому матеріалі методів має як перевагами, так і недоліками, вираженими в тій чи іншій мірі. Швидкість отримання відповіді, можливість обстеження великої кількості проб одночасно, складність методу і необхідність використання дорогої апаратури і реагентікі, чутливість методу і його специфічність і, в кінцевому рахунку, вартість одного аналізу кожного з цих методів істотно відрізняються. Звідси - вибір адекватного методу в кожному окремому випадку індивідуальний і представляється непростим завданням через численність тестів, різних можливостей діагностичної лабораторії і завдань, що стоять перед ними.