Вірусологічні дослідження. Кишкові захворювання. (Частина 2)

Застосування ПЕМ виявило високу специфічність методу, проте його чутливість поступалася ряду інших лабораторних тестів. Дослідження 207 матеріалів від хворих з двома діагностичними наборами ІФА і ПЕМ як референс-методу показало, що чутливість ПЕМ склала 80% при 100% специфічності, тоді як чутливість ІФА на основі моноклональних антитіл була вищою (Dennehy Р., 1990). Аналогічні дані були отримані раніше Васильєвим Б. Я. та ін. (1989). Порівнянні співвідношення показників чутливості і специфічності ПЕМ і реакції аглютинації латексу (62,5% і 75% відповідно) були показані також Santos N. і Nozawa С. (1989).

Дослідження останніх років підтвердили ці дані. Обстеження 103 дітей методами ПЕМ, ЕФ в ПААГ і реакцією латекс-аглютинації (РЛА) показало, що ротавірус був документований у 18% дітей. Причому чутливість методів ПЕМ, ЕФ в ПААГ і РЛА склала відповідно 84%, 90% і 80%, специфічність ж 100%, 100% і 81% відповідно (Hendricks М. К. et al., 1995). Крім діагностичних цілей, ПЕМ застосовується і в науково-дослідних розробках. Так, Zeng С. et al. (1994) використовували ПЕМ при вивченні рота-вірусного білка VP2.

Результати прямої електронної мікроскопії розширили уявлення про функції та складанні структурного білка VP2, а також формуванні вірусоподібних частинок (ВПЛ) і транспорті метаболітів всередині віріона.

Особливо великі успіхи були досягнуті у вивченні морфології ротавірусів за допомогою модифікації ПЕМ - кріое-лектронной мікроскопії, яка дозволяє вивчати нативний, незабарвлений віріон з роздільною здатністю 35А, що дозволяє виявити поверхневі структури вірусу і канали, що пронизують вирион (Yeager М. et al., 1990- 1994, Estes М., 1996 Prasad В. et al., 1996).

Таким чином, пряма електронна мікроскопія залишається ефективним діагностичним методом і оптимальним рефе-Ренс-тестом при освоєнні нових діагностичних методик з огляду на незаперечності одержуваних при цьому результатів, внаслідок чого ряд дослідників вважають електронну мікроскопію «золотим стандартом» (Bryden А. S., 1990). Унікальність ПЕМ складається і в її здатності виявляти крім всіх груп ротавірусів та інші кишкові патогени: адено-, каліці, астро- і короновіруси, а також невідомі дотепер інфекційні агенти (Espinoza F. et al., 1997).

Іммуноелектронная мікроскопія (ІЕМ) дає можливість не тільки ідентифікувати вірус в матеріалах від хворого за його морфологічними ознаками, але і підтвердити етіологію захворювання на специфічному рівні. Принцип проведення дослідження полягає в наступному: імунну сироватку до ротавірусу в розведенні 1: 5 змішують з 0,4 мл 1% освітленої центрифугуванням фекальної суспензії. Суміш витримують 1 годину при кімнатній температурі, 12 годин при 4 ° С, потім центрифугують протягом 90 хвилин при 15 000 об. / Хв для осадження вірусних частинок і імунних комплексів. Надоса-дочно рідину зливають, а осад ресуспендіруют в декількох краплях дистильованої води, фарбують (як уже було сказано вище) і наносять на предметні сітки. Мікроскопію препаратів здійснюють при збільшенні 50 000.

В цьому випадку частинки ротавірусу з характерною морфологією і розмірами виявляються у вигляді специфічних імунних комплексів, інтенсивність утворення яких оцінюють за кількістю скупчень на сітці і висловлюють за умовною шкалою від 0 до 4 +.

За чутливості і специфічності ІЕМ може змагатися не тільки з ПЕМ, але навіть з таким поширеним методом, як ІФА. Так, при типування 24 штамів ротавірусів за допомогою ІФА та ІЕМ на основі моноклональних антитіл до VP7 виявилося, що ІЕМ в 2-16 разів чутливіші, ніж ІФА (Gerna G. et al., 1988).

Крім стандартної техніки ІЕМ в роботах ряду авторів проведено вивчення специфічності і чутливості декількох модифікацій цього методу: фільтрація комплексу в агар, іммуносорбентний ІЕМ і макромаркірованія комплексом білок А колоїдне золото. Показано, що всі модифікації ІЕМ, як мінімум, в 20-30 разів чутливіші прямий методики. Найбільшою чутливістю відрізняється варіант з міткою білком А - колоїдне золото, який виявився в 1000 разів чутливіші, ніж прямий метод ІЕМ (Athanassions R. et al., 1994- Gonzalez S. A. et al., 1995). Очевидно, що подальше удосконалення ІЕМ відкриє нові можливості для цього методу, але його висока чутливість може бути реалізована при ретельній стандартизації реагентів, забезпечення кон-тролями, а також при високій кваліфікації дослідника.

Область застосування ІЕМ досить велика: науково-дослідні розробки, клінічна практика, лабораторна діагностика, включаючи типування штамів ротавірусів, розшифровка епідемічних спалахів і ін. (Gerna G. et al., 1988- Васильєв Б. Я. та ін., 1989- Bates Р. R. et al., 1993- Oishi J. et al., 1993- Zeng C. et al., 1994- Tokieda M. et al., 1996).

ІЕМ (як і ПЕМ) застосовують також як референс-тесту для оцінки показників чутливості і специфічності комерційних діагностичних наборів (Ruggeri F. et al., 1992). Ілюстрацією цінності використання методу ІЕМ в розшифровці епідеміологічних спалахів можуть служити дані Oishi J. (1993). Так, під час спалаху гастроентеритів у студентів одного з коледжів в Японії методом ПЕМ за морфологічними ознаками в фекаліях хворих були виявлені ротавіруси. Причому ці матеріали виявилися негативні в ІФА щодо ротавірусів групи А. Застосування ІЕМ показало, що ці ротавіруси відносяться до збудників групи С, що в подальшому було підтверджено даними ПЛР.

Підсумовуючи результати застосування ПЕМ і ІЕМ, слід зазначити, що ці методи мали першорядне значення на початкових етапах діагностики ротавірусної інфекції. Однак надалі, з розробкою прийомів виявлення ротавірусної-го антигену, що перевершують ПЕМ і ІЕМ по чутливості, простоті і швидкості проведення, можливості масового обстеження великих контингентів при низьких матеріальних витратах, ПЕМ і ІЕМ відводиться почесна роль референс-методів.

У той же час ПЕМ і ІЕМ і до теперішнього часу використовуються в науково-дослідній та клінічній практиці як методи виявлення нових,-невідомо інфекційних агентів.

Імунофлюоресцентний метод (ІФМ) застосовується в діагностичних дослідженнях для виявлення антигену в клітинній культурі, зараженої матеріалом від хворого, в біоптатах і секційному матеріалі, а також в копроматеріалах в двох модифікаціях.

Принцип прямого методу ІФМ зводиться до обробки об`єкта (заражених клітин або зрізів тканин) специфічними антитілами, міченими флюоресцирующим барвником, які, контактуючи з антигеном, дадуть в люмінесцентному мікроскопі під впливом короткохвильового частини спектру видиме довгохвильове світіння (зелене або червоне залежно від виду барвника) . При непрямому методі ІФ об`єкт піддають двоступеневої обробці спочатку імунною сироваткою до шуканого антигену, а потім міченими флюорохромом імуноглобулінами, виділеними з антивидовой сироватки.

Методика проведення ІФМ надзвичайно проста: мазки-відбитки, заражені клітини, освітлена суспензія фекалій фіксуються на предметних стеклах ацетоном при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Потім препарат обробляють антіротавірусной флюоресцирующей сироваткою при одночасному контрастировании фону кон`югатом альбумін-родаміном. Після інкубування при 37 ° С протягом 30 хвилин, надлишок кон`югату відмивають фосфатним буфером (pH 7,0), промивають, висушують і переглядають в люмінесцентному мікроскопі. Слід зазначити, що взяття копроматеріалов в перші години від початку захворювання збільшує можливість виявлення ротавирусного антигену. При проведенні ІФМ необхідне включення контролів, в якості яких застосовуються: обробка специфічним кон`югатом неінфікованих-них клітин, а також - гетерологічним кон`югатом клітин, інфікованих ротавирусом. Найбільш часто ІФМ використовується при дослідженні культури тканини, зараженої матеріалами від хворих людей або тварин, що дозволяє швидко виявити віруссодержащіе.клеткі, не чекаючи ЦПД (Мников-ва Л. А., 1988- Harsi C.et al., 1991 Tokieda M . et al., 1996). Так при обстеженні в ІФМ і ЕФ в ПААГ 268 хворих гастроентеритами дітей до 1 року було виявлено 40 позитивних проб (14,9%), в іммунноферментном тесті - 46 (17,1%). Збіг результатів цих методів спостерігалося в 72% випадках (Harsi З et al., 1991).

В останні роки иммунофлюоресцентная мітка антитіл широко використовується для виявлення фокусів (Пляка) ротавірусів в культурі клітин, що істотно підвищує чутливість цього методу (Isa P.et al., 1994- Barnes G. et al., 1997). Застосовується ІФМ і з метою виявлення ротавірусів у зовнішньому середовищі (Strappe Р., 1990).

Таким чином, в даний час імунофлюоресцентним метод дослідження в класичному варіанті знаходить обмежене застосування в діагностиці ротавірусних гастроентеритів.

Преціпітаціонние тести засновані на взаємодії специфічної сироватки з вірусними антигенами в агарі під впливом осмотичних процесів (РПГ) або при впливі постійного електричного поля - зустрічний іммуноелектрофорез (ВІЕФ) (Галко Н. В. та ін., 1986 Залеських А. Ф. та ін ., 1990). Зазначені методи були використані на початкових етапах вивчення ротавірусної інфекції та в даний час практично не застосовуються в зв`язку з розробкою більш досконалих тестів, за винятком тонких наукових досліджень (Devitt С. et al., 1993). Правда, в останні роки преціпітаціонние тести були вдосконалені шляхом введення в реакцію ротавірусних частинок, мічених 32Р, що дозволило збільшити як чутливість, так і специфічність методу (Tosser J. et al., 1994- Johansen К. et al., 1994- Richardson S . et al., 1993- Colomina J. et al., 1998), а також білка а золотистого стафілокока (Colomina J. et al., 1998).

Імуноферментний аналіз (ІФА) в діагностиці ротавірусних гастроентеритів застосовується найбільш широко. Число публікацій на цю тему налічує кілька сотень.

Принцип методу твердофазних ІФА зводиться до того, що якийсь носій з полімерного матеріалу (лунки мікропанелей, намистинки, палички і т. Д.) Сенсибилизируют антитілами до ротавирусам, додають досліджуваний матеріал від хворого і інкубують при 36 ° С. Утворився комплекс АТ-АГ виявляють або антитілами, міченими ферментам, або спочатку обробляють сироваткою до шуканого антигену, а потім антіві-довимі імуноглобулінами, міченими ферментом. Виявлення комплексу АТ-АГ-АТ + фермент або АТ-АГ-АТ 1 АТ2 + фермент здійснюють додаванням субстрату для появи пофарбованого продукту реакції. Облік результатів реакції проводять за допомогою імуноферментних аналізаторів. Крім виявлення ротавирусного антигену ІФА дозволяє також проводити серотіпірованіе ізолятів безпосередньо в матеріалах від хворих. Для цієї мети було запропоновано метод блокування певних епітопів генома RV за допомогою моноклональних антитіл типовий або подгрупповой специфічності (Green К. et al., 1990). Застосування моноклональних антитіл VP7 і VP4 різних серотипів ротавірусів людини дозволяє провести не тільки типування ізолятів, а й сприяє вивченню епідемічних процесів (Bishop R. et al., 1989- Gerna G. et al 1989- UnicombL. Et al., 1993- Buesa G . et al., 1996 Gomez J. et al., 1990 Begue R. et al., 1992 Coulson BS, 1993- Woods P. et al., 1992 Nirdnoy W. et al., 1995 Wu H . et al., 1998 Masen-dyzac P. et al., 1998).

Перші набори ІФА були створені як лабораторні тести в кінці 70-х років, потім були розроблені комерційні препарати. Першим комерційним набором є Rotazyme (Abbot Laboratories Ltd), в якому використовували кулькову систему. Потім Dako Ltd створило більш досконалий набір - Fast Elisa Dako Ltd, і в даний час число комерційних тестів, використовуваних в діагностичній практиці, надзвичайно велике: IDEIA Rotavirus test, Dakopatts, тест-система WHO, Testpack Rotavirus, Rotavirus EIA, Pathfinder, Kallestadt | Rotaclone, Rotavirus BIO - Bioenzabead Litton, Rotazyme II Abbott, Rotoscreen, Wellcozyme, Enzymgnost Rotavirus, Rotavirus Immunoassay, VIDAS Rotavirus, NIV (Gowez J. et al., 1990 Begue R. et al., 1992 Rosmus K. et al ., 1992 Kelkar S., 1993- Unicomb L. et al., 1993- Sanchez R. et al., 1993- Broor S. et al. `1993- Dennehy P. et al., 1994).